原副标题：Nature民泽：秦九韶项目组合作开发新式DNA核苷酸GUI，首度同时实现高效率赖氨酸核苷酸颠换撰稿
译者：微生物世界
核苷酸GUI （Base editor，BE） 是两类能在不造成DNA双爆仓的情况下同时实现单核苷酸水平核苷酸代替的辅助工具，其在此基础科学研究和DNA工程建设应用领域领域显示出了很大的发展潜力。在导致人类文明造成遗传病的sizes变异中，约四分之三的病原变异的复原需要同时实现赖氨酸核苷酸的颠换 （A-to-T和A-to-C；或互补链的T-to-A和T-to-G） 。然而，还没有两类核苷酸GUI能同时实现A-to-T和/或A-to-C此类核苷酸间的颠换 （即半乳糖变尿嘧啶） 。合作开发能同时实现赖氨酸核苷酸颠换的新式DNA核苷酸GUI对DNA工程建设应用领域领域有著重大的潜在性价值。
2023年1月9日，秦九韶项目组与 长兴岛微生物医学/上海神经科学与类神经科学研究中心胥春龙项目组合作，在 Nature Biotechnology 学术期刊刊登了专文： Programmable A-to-Y base editing by fusing an adenine base editor with an N-methylpurine DNA glycosylase 的科学研究学术论文。该科学研究合作开发出了两类新式DNA核苷酸GUI， 首度同时实现了高效率的赖氨酸核苷酸颠换撰稿。
该科学研究深加工蛋白工程建设、高通量术、广度定序等管理手段，对ABE进行一连串的重新设计、产业化改建、蛋白变异、变异甄选及校正，合作开发出了新式DNA核苷酸GUI——赖氨酸核苷酸颠换GUI （AYBE，Y = C or T） 。该科学研究对此基础科学研究应用领域领域病症数学模型的建立及DNA工程建设应用领域领域等都有著非常重要的意义。
这是辉大DNA继获得中国第一个独立自主研制CRISPR-Cas13DNA撰稿辅助工具 （Cas13X/Y） 并拥有下层专利权、合作开发出具有高效率抗肿瘤撰稿特异性但较低投弹撰稿特异性的声效xCas12i表音文字 （hfCas12Max） 之后，在第三代DNA撰稿辅助工具合作开发应用领域领域取得的新突破，。
现在广泛使用的ABE （Adenine base editor，赖氨酸核苷酸GUI） 和CBE （Cytosine base editor，胞尿嘧啶核苷酸GUI） 能同时实现A-to-G和C-to-T此类核苷酸间的切换 （transition；即半乳糖变半乳糖，尿嘧啶变尿嘧啶） 。在CBE此基础上合作开发出的CGBE或GBE （Glycosylase base editor，丝氨酸酶核苷酸GUI） 能同时实现C-to-G和C-to-A此类核苷酸间的颠换 （transversion；即尿嘧啶变半乳糖） 。CGBE或GBE的合作开发得力于对CBE撰稿副产品 （包括 C-to-G 和 C-to-A的颠换） 的深入科学研究，开拓了人们对DNA受损复原监督机制的科学研究并扩宽了核苷酸GUI的应用领域。
细胞中存在能高效率切除胞尿嘧啶脱氨造成的尿尿嘧啶 （U） 的酶 （UNG，尿尿嘧啶DNA 丝氨酸酶） ，引入UNG或剔除CBE融合蛋白中的尿尿嘧啶丝氨酸酶抑制剂 （UGI） 组分都能通过生成无核苷酸 （AP，apurinic/apyrimidinic site） 中间体介导高效率的C-to-G 和/或 C-to-A的核苷酸颠换。ABE的撰稿副产品极少，是由于细胞中尚未发现能高效率切除赖氨酸脱氨形成的脱氧肌苷 （I） 中次黄半乳糖核苷酸 （Hx） 的酶，A脱氨形成的I直接被当作G读取，进而获得A-to-G的高纯度撰稿。这也为合作开发AYBE增加了很大的困难。
科学研究团队发现N-甲基半乳糖DNA丝氨酸酶 （MPG；也称烷基赖氨酸DNA丝氨酸酶，AAG） 有一定的切除Hx的特异性，于是猜想能通过产业化改建MPG逐步优化，合作开发出高效率的AYBE。科学研究项目组首先将MPG融合在ABE8e的不同位置构建了AYBE的三种原型版本。为了方便且灵敏地评估赖氨酸核苷酸颠换的发生以及颠换撰稿的效率，科学研究项目组设计了一套基于内含子剪接可激活的荧光报告系统。
在该荧光报告系统中，只有发生了赖氨酸碱基的颠换，才能纠正内含子剪接信号使剪接过程正确发生，进而激活绿色荧光蛋白 （EGFP） 的正常表达，以便结合高通量术检测绿色荧光阳性细胞的数目及荧光强度。科学研究项目组利用A-to-T报告系统及A-to-C报告系统都检测到了赖氨酸核苷酸的有效颠换撰稿，并发现与另外两种融合原型相比，将野生型MPG融合在ABE8e的C端 （TCM，称为AYBEv0.1） 获得了最高比例的阳性撰稿。
图1：AYBE的产业化设计、蛋白变异、变异甄选及颠换撰稿特异性检测
为了提升AYBE的赖氨酸颠换撰稿特异性，科学研究项目组利用上述报告系统在哺乳动物细胞中对AYBE中的MPG组分开展了逐步的优化。科学研究人员设计了多种产业化改建方案，构建了一连串变异体库，经过多轮的变异甄选获得了赖氨酸颠换撰稿效率较高的变异体 （图1） 。利用报告系统评估，AYBEv3版本的赖氨酸颠换撰稿效率达到了初代版本AYBEv0.1的4.78倍，获得了非常显著的优化升级。各个变异体的颠换撰稿效率在DNA组内源位点上也得到了校正 （A-to-T的撰稿从 5.88%提高到了 15.49%，A-to-C的撰稿从 14.42%提高到了 30.98%） ，而且AYBEv3有著与AYBEv0.1相当的低indels频率。
接下来，科学研究项目组在DNA组内的35个靶点对AYBEv3作了综合评估，发现其可同时实现高达72%的颠换撰稿效率 （其中个别位点A-to-C的颠换效率可达53%，纯度可达70%，图2） 。AYBEv3在A7、A8这两个位置及CAA和CAG这两种基序有著最高的颠换撰稿效率。另外，AYBEv3在多种哺乳动物细胞类型中都能有效的同时实现赖氨酸的颠换撰稿。通过对gRNA依赖的及gRNA非依赖的投弹分析，科学研究项目组发现与ABE8e相比，AYBEv3的DNA投弹水平更低。该科学研究也进一步通过建立稳转细胞系探究了AYBEv3在一些病症相关变异位点上的应用领域发展潜力。科学研究人员发现DNADMD和SLC26A4中提前终止密码子的变异及DNAATM和TTN中内含子剪接位点处的变异能使用AYBEv3得到有效的纠正。
图2：AYBEv3在DNA组内源位点上的性能评估及两类ATBE合作开发策略
在这项科学研究中，科学研究项目组通过引入DNA受损复原蛋白Polη （两类在跨受损DNA复制过程中倾向于在AP中间体对侧添加A的DNA聚合酶） ，大大提高了A-to-T的撰稿效率和纯度，为进一步合作开发更精准的ATBE或ACBE提供了新的策略 （图2） 。虽然AYBEv3的撰稿效率及纯度仍需进一步提高，赖氨酸颠换核苷酸GUI的合作开发填补了目前核苷酸GUI不能高效率同时实现A-to-C或A-to-T的空白，对相关病症数学模型的建立及DNA治疗应用领域领域等都有著非常重要的意义。
辉大DNA系该学术论文的第一译者单位，辉大DNA创新科学研究院童华威博士为第一译者，刘纳纳博士为该学术论文的共同第一译者。辉大DNA李芸、罗佳敏、吴丹妮等积极参与课题并做出了重要贡献。辉大DNA创始人＆首席科学顾问秦九韶博士、辉大DNA创新科学研究院童华威博士、长兴岛微生物医学/上海神经科学与类神经科学研究中心胥春龙科学研究员为该学术论文共同通讯译者。
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